【知識分享】PCR實驗室為什么要進行三區隔離?

行業新聞 | 2021-06-17

PCR實驗總是出現假陽性,明明沒有加模板,最后卻擴出了產物。如果這種現象頻頻出現,就要注意一下操作環境了。

這里涉及氣溶膠的概念,氣溶膠是由固體或液體小質點分散并懸浮在氣體介質中形成的膠體分散體系,能在空氣中滯留至少幾個小時。

PCR反應過程中不斷進行升溫降溫,液體蒸發又冷凝,PCR管中部分空氣形成氣溶膠,攜帶大量的DNA擴增產物(注意,1ng擴增產物中可作為模板的DNA片段數量,超過1ng起始模板中可擴增DNA片段數量的幾百萬倍甚至更高。比如人的基因組DNA有30億個bp,要擴增的單拷貝基因片段是300bp,1ng起始模板中可以作為模板DNA片段只占總起始模板DNA總量的千萬分之一)。如果在實驗室打開含PCR擴增產物的管蓋,大量攜帶DNA擴增產物的氣溶膠就會涌出,擴散到空氣中,從而對環境造成污染。

雖然在整個空間環境中DNA的含量很低,但由于理論上只要有1個可做為模板的DNA片段也能PCR擴增成功,這就是為什么在污染環境中陰性對照也能擴增出條帶的原因。

所以在專業的PCR實驗室(比如臨床PCR檢驗實驗室),通常有四區隔離(或至少是三區隔離)的要求。 

 

 常見的三區是指:

 

1、試劑配制區:PCR反應體系的配制區域。 

2、標本處理區:包括擴增模板的制備,即提取DNA的地方。

3、PCR擴增和產物分析區:進行PCR擴增的區域,也是擴增產物進行凝膠電泳分析的區域。 

如果將PCR擴增區域和產物分析區再次分開,就是四區隔離。四區隔離,主要目的是防止氣溶膠在各個PCR區域之間的流動,最好的方法是每個區域隔一幢樓,但操作起來不現實,于是便有了針對不同區域設置正負壓的方法: 

 

試劑配制區(Ⅰ區):最潔凈的區域,保持微正壓使得外界空氣無法進入隔離污染源。并且陰性模板應該在此區加入PCR管并蓋蓋,嚴禁在此區域打開、存放裝有DNA模板的離心管。

DNA模板添加區(Ⅱ區):壓力比Ⅰ區低,保證內部空氣不外泄,以免陽性模板的氣溶膠對外界環境造成污染。

擴增及PCR產物分析區(Ⅲ區):保持負壓,使得內部空氣不外泄,以免擴增產物的氣溶膠對外界環境造成污染。

 

操作時壓力遵循Ⅰ區→Ⅱ區→Ⅲ區單一方向進行,不可逆向進行。 



既然PCR三區隔離的目的是為了阻斷氣溶膠的交流,請注意以下細節,思考一下氣溶膠來自哪里:

 

1. 每個區域都應配備專用的移液器,不可交叉混用。我們的一位用戶拿電泳室的移液器加模板,陰性對照擴出了很亮的條帶。 

2. 每個區域都應配備專用的移液器吸頭,不可交叉混用。 

3. 如果條件允許,在PCRⅢ區工作結束后再次進入PCR I區需要更換實驗服、一次性鞋套、帽子、手套。 

4. 在PCR I區、PCRⅡ區配備帶濾芯吸頭。